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Western 免疫印跡

簡要描述:Western免疫印跡(Western Blot)是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上,然后利用抗體進(jìn)行檢測。對已知表達(dá)蛋白,可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測,對新基因的表達(dá)產(chǎn)物,可通過融合部分的抗體檢測。

  • 產(chǎn)品型號:
  • 廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家
  • 更新時間:2024-05-13
  • 訪  問  量:4296

Western免疫印跡

    Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測物是蛋白質(zhì),“探針”是抗體,“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì),且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。

Western Blot操作步驟
(一)蛋白質(zhì)樣品獲得:細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)后,可通過電泳上樣緩沖液直接裂解細(xì)胞,真核細(xì)胞加勻漿緩沖液,機(jī)械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然后4℃,13,000g離心15min。取上清液作為樣品。
(二)電泳:制備電泳凝膠,進(jìn)行SDS-PAGE。
(三)轉(zhuǎn)移:(半干式轉(zhuǎn)移)
1、電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小,用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡,5min×3次。
2、膜處理:預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜,浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10min。
3、轉(zhuǎn)膜:轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板的順序放好,濾紙、凝膠、NC膜精確對齊,每一步去除氣泡,上壓500g重物,將碳板上多余的液體吸干。接通電源,恒流1mA/cm2,轉(zhuǎn)移1.5hr。轉(zhuǎn)移結(jié)束后,斷開電源將膜取出,割取待測膜條做免疫印跡。將有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色,放入膜染色液中50s后,在50%甲醇中多次脫色,至背景清晰,然后用雙蒸水洗,風(fēng)干夾于兩層濾紙中保存,留與顯色結(jié)果作對比。
(四)免疫反應(yīng):
1、用0.01M PBS洗膜,5min ×3次。
2、加入包被液,平穩(wěn)搖動,室溫2hr。
3、棄包被液,用0.01M PBS洗膜,5min×3次。
4、加入一抗(按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋,液體必須覆蓋膜的全部),4℃ 放置12hr以上。陰性對照,以1%BSA取代一抗,其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。
5、棄一抗和1%BSA,用0.01M PBS分別洗膜,5min×4次。
6、加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(按合適稀釋比例用0.01M  PBS稀釋),平穩(wěn)搖動,室溫2hr。
7、棄二抗,用0.01M PBS洗膜,5min×4次。
8、加入顯色液,避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應(yīng)。

Western Blot注意事項(xiàng)
1、一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定*條件。
2、顯色液必須新鮮配置使用,zui后加入H2O2。
3、DAB有致癌的潛在可能,操作時要小心仔細(xì)。

 

 

 

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